产品信息
适用范围 | 试剂 |
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使用方法 | 一、试剂配制 1. 培养瓶包被液:18ml PBS加入本试剂盒1支试剂Ⅰ、1支试剂Ⅱ。 2. 增殖培养基:每1000ml免疫细胞无血清培养基中加入本试剂盒1支试剂Ⅴ。 3. 活化培养基的配制:配制完增殖培养基后,取出500ml增殖培养基,加入本试剂盒1支试 剂Ⅳ、1支活化培养基添加物。 二、取材 取材时使用一次性负压采血管抽取自体外周血 50ml。(建议使用枸橼酸钠或肝素抗凝剂) 或临床获得健康新生儿脐带血。(建议使用枸橼酸钠或肝素抗凝剂)。 三、NK细胞的培养(2L体系) 1. 培养前:T175培养瓶中加入包被液,2-8℃冰箱过夜,或置于37℃培养箱中至少包被2h。 2. 第0天:取出2支高效离心管,分别加入15ml样本密度分离液,200g离心1min,确保离 心后隔片下充满分离液,隔片上有0.5-1cm高度分离液。小心将25ml抗凝血缓慢沿管壁 加至分离液界面上,确保血液及分离液之间有明显界面(每管可加15-25ml血液,若超过 25ml,则分管)。600g,离心30min(也可根据实际情况进行调节),注意慢升慢降。 3. 离心后可观察从上至下分为4层,淡黄色血浆层,白色环状PBMC层,分离液层,红细胞 层。用吸管吸取血浆层,做灭活处理。 灭活步骤:置于水浴锅中56℃,30min;然后-20℃静置10min;最后800g,离心 15min,保留上清弃去沉淀,短期保存于4℃备用,长期保存请置于-20℃~-80℃环境下。 4. 用吸管吸取PBMC细胞层至50ml离心管中,为尽量获得更多细胞,建议隔片以上部分全 部吸取,注意不要吸到红细胞。在PBMC离心管中加入PBS混匀(PBS量要多于吸取的 PBMC体积),600g,离心10min。弃去上清,加入PBS复溶洗涤,300g,离心10min。 分离出的PBMC用未加任何因子的免疫细胞无血清培养基配制成细胞悬液40ml,加入1整 套试剂Ⅲ(5支全部加入),加入1支试剂Ⅸ。将上述所有液体加入到弃掉包被液的培养 瓶中,加入8ml自体血浆,置于饱和湿度、37℃、5.0% CO2培养箱中培养。 (注:建议接种密度为 1-3×106 个/ml,如分离后细胞数少,则相对应减少培养基及血 浆使用量,但是活化因子添加量不变。) 注意:先使用完所有活化培养基,再使用增殖培养基。由于个体差异问题,每个样本生 长速度不一致,添加培养基的时间不一定要严格按照以下时间进行,需根据具体情况具 体分析, 确保细胞已经活化成功,呈现聚团生长的情况,细胞数量有增殖。在补加培养 基后,细胞密度维持在 1×106 个/ml,有利于细胞的生长。 5. 第 3 天加入 40ml NK 活化培养基,加入 5ml 血浆,加入 1 支试剂Ⅸ,1 支试剂Ⅵ。 6. 第5天加入70ml NK活化培养基,加入5ml血浆,加入1支试剂Ⅸ,1支试剂Ⅶ。 7. 第7天将培养瓶中细胞完全吹打下来,轻轻摇匀瓶内培养液,无菌取出0.5ml-1ml细胞液 计数,视细胞生长状态及细胞密度,建议加入剩余自体血浆并补加剩余的活化培养基。 转移到1个培养袋。 8. 第9天:轻轻摇匀袋内培养液,无菌取出0.5ml-1ml细胞液计数,视细胞生长状态及细胞 密度,建议培养袋补加增殖培养基500ml。 9. 第12天轻轻摇匀袋内培养液,无菌取出0.5ml- 1ml细胞液计数,视细胞生长状态及细胞 密度,建议培养袋补加增殖培养基1000ml 。此时取样做细菌、真菌、支原体、内毒素 检测。 注:如需继续扩增培养体系至4L,请购买本公司免疫细胞培养基1L * 2 瓶、2支Ⅴ号因 子、1个 2.5L体系悬浮细胞培养袋。 四、扩增步骤 1. 第13-15天视细胞生长状态及细胞密度选择适当扩增时间,轻轻摇匀袋内培养液,无菌取 出0.5ml- 1ml细胞液计数,无菌条件下取出袋内一半的培养基,转至一个新的培养袋内。 配制增殖培养基:每1L免疫细胞培养基 加入1支Ⅴ号因子; 建议向两个培养袋内各补加 1000ml 增殖培养基。 2. 第15天收集NK细胞悬液2000ml,1500rpm×5min离心后弃去上清液,250ml离心管集 2管每管生理盐水200ml洗涤(1500rpm×8min)1次,再用50ml离心管生理盐水100ml 洗涤(1200rpm×5min)1次,按照100ml生理盐水+8ml 20%人血清白蛋白重悬细胞, 封装好后送病房,同时留样封存以备日后检测。 |
注意事项 | 1. 使用前请仔细阅读本试剂盒说明书,并严格按照说明书执行操作。 2. 本试剂盒必须按规定温度保存,不可反复冻融。试剂在使用前需解冻,并充分混匀,不 可剧烈震荡。 3. 可视细胞生长的实际状况适当调整补液时间和用量。 |
声明 | 仅用于科研使用,不能用于临床诊断和治疗。 |
保存条件 | 根据说明书内容,有效期12个月。 |
产品详情
超级 NK 细胞无血清培养试剂套装(2L)是一款专为 NK 细胞培养而设计的无血清、无异源 动物成分的扩增培养试剂盒,产品性能高,质量稳定,适用血液类型范围广。超级 NK 细胞 培养方案将血液中内源性的 CD34+细胞诱导转化为 NK 细胞,且可抑制 T 细胞的增殖,因 此本款细胞因子试剂盒培养后 NK 纯度(CD3-CD16+CD56+)更高,新鲜脐带血、外周血 来源培养后 NK 纯度稳定在 95%以上,冻存细胞培养后 NK 纯度稳定在 85%以上。