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产品信息
| 适用范围 | 试剂 |
|---|---|
| 使用方法 | 1. 软骨分化培养基预混液配制：室温融化添加物 B 和添加物 C，融化后加入 A 液，充分混 匀，配制成软骨分化培养基预混液（2-8℃保存）。 2. 诱导完全培养基配制：取 10ml 预混液置于 15ml 离心管中，加入一支添加物 D，充分混 匀制成诱导完全培养基，此液现配现用。1ml 预混液需加入添加物 D 的量为 10μl。 诱导完全培养基现配现用，2-8℃放置不得超过 72 小时。 3. 准备所需诱导分化的MSC，当细胞融合达85%左右时，用消化液消化细胞，细胞沉淀用 成软骨诱导预混液重悬。 4. 220g离心5分钟，沉淀以预混液重悬，细胞密度约2×106cells/ml，再次离心，弃上清。 5. 沉淀以成软骨诱导完全培养基重新悬浮，调整细胞密度为2×106cells/ml。 6. 分别取500μl细胞悬液接种于15 ml离心管中，220g离心5分钟。 每管细胞的总数在5×105至1×106之间，一般以1个T25细胞培养瓶接种一个软骨球为 佳，细胞数过少形成的软骨团块较小，细胞数过多则可能会分开成块。正常情况下可 形成1-2 mm3的团块。离心以细胞聚团为准，可适当调整。 7. 旋松离心管盖，将离心管轻轻竖直置于37℃、5% CO2培养箱中静置培养。 24小时内避免摇动细胞沉淀，以确保形成个团块。离心管需使用聚丙烯材质无菌管。 8. 诱导培养24小时后，轻轻拨动离心管底，使细胞沉淀团块悬浮，重新放回培养箱继续养。 细胞团块重新悬浮的时间因细胞而定，基本在24-48小时之间，以细胞团周围有聚拢 现象时为准。若细胞团块贴壁较牢固，可用移液器轻轻吹动使其悬浮，注意不要吹散 团块。 9. 每2天更换新鲜完全诱导培养基。换液时轻轻吸去旧培养基，每管加新鲜配制的成软骨分 化完全培养基500μl。 换液时动作轻柔，以免吸出细胞团块；诱导完全培养基必须经过复温，否则影响诱导 效果。在诱导培养2-3周后会出现大量细胞外基质，富含软骨蛋白多糖和Ⅱ型胶原。 10. 诱导培养14-20天，弃去培养上清，DPBS洗细胞两次，4%中性多聚甲醛溶液2ml/管室 温固定细胞1小时。 培养结束时或中途可以选择其他检测方法，如基因表达检测等，采用自己拟定的检测 方法则后续方案需要自行确定。 11. 弃去固定液，DPBS洗2次，脱水、石蜡包埋后切片（过程中一定注意团块不要丢失）。 12. 阿利新蓝染色：将切片进行脱腊和复水，阿利新蓝染液染色30分钟，流水冲洗5分钟，脱 水、透明、中性树胶封片，显微镜下观察、拍照。 13. 结果判定：按照程序操作完毕，低倍镜下观察可见蓝色着色，该蓝色染色的为酸性粘多 糖，说明实验所用的MSC具有成软骨能力。否则，所使用的MSC无成软骨能力。 该鉴定方法和判定标准为定性实验标准，可根据具体情况设置其他判定方法和标准。 以上提供的是包埋切片染色的方案，若实验室条件限制，可选择直接对团块进行染色， 方法见11*、12*、13*。若试剂盒用于组织工程软骨诱导，可作为除支架材料以外的 诱导液用。 11*. 弃去固定液，DPBS洗团块2次。 12*. 阿利新蓝染色：向团块中加500μl阿利新蓝染液染色30分钟。弃染色液，加纯水 5ml摇动清洗5分钟/次，反复洗5次。 * 操作过程中避免样本丢失，样本始终需要保持在液体中，避免失水导致形态改变。 13*. 结果判定：按照程序操作完毕，低倍镜下观察可见深蓝色着色，肉眼观察也可见蓝 色着色，该蓝色染色的为酸性粘多糖，说明实验所用的MSC具有成软骨能力。否则，所 使用的MSC无成软骨能力。 |
| 注意事项 | 1. 本产品所有组分均须避免反复冻融，各组分在所需要的温度下有效期为 1 年，配制完成的 预混液于 2-8℃保存，有效期 1 个月，完全培养基现配现用，2-8℃保存不超过 72 小时。 2. 染色和制片过程中避免干片或失水，干片或缺水后会导致组织形态发生变化，影响观察、 拍照效果。根据需要可以选择细胞核复染，不建议苏木素复染，可以使用核固红复染。 3. 染色过程中，染色液中的团块不易看清，务必小心吸去上清，避免样本丢失。样本始终 需要保持在液体中，避免失水导致形态改变。 4. 染色时间请根据实际情况确定，时间控制在10-30分钟，时间太久颜色过深，可能不易分 辨。 5. 使用直接进行诱导球染色时诱导周期可以适当缩短，一般情况下15天即可有蓝色着色， 时间越久蓝色着色相对越深。具体诱导周期根据实验室的具体情况进行调整。 6. 结果拍照最好使用反射光拍照设备，用透射光的显微镜会导致结果呈深蓝色或黑色。 7. 如果试剂外包装管出现裂缝，应立即停止使用。 8. 操作过程应在无菌环境下进行，必须保证操作过程中使用的所有容器及所有直接接触细 胞液的器具严格无菌。 |
| 声明 | 仅用于科研使用，不能用于临床诊断和治疗。 |
| 保存条件 |
产品详情
间充质干细胞（MSC）具有多向分化的潜能，在一定条件下可以体外诱导分化为脂肪细胞、 成骨细胞、成软骨细胞，是 MSC 鉴定的必检项目，在多种组织来源和制作方法的 MSC 药品 质量控制中，成骨、成脂、成软骨也是必检指标。BDBIO 人间充质干细胞成软骨诱导试剂盒 可用于鉴定人 MSC 是否具有成骨分化能力，满足 MSC 质量控制的要求，此外在再生医学和 组织工程研究中，诱导培养基也可作为除支架以外的培养体系。诱导培养基还可用于研究诱 导分化过程中的其他检测，如 mRNA 检测、lncRNA 检测、microRNA 检测、蛋白表达检测、 钙沉积量检测、免疫组化检测等。
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